Принципы выбора животных для научных исследований. Сообщение 1. Выбор модельных организмов на основании филогенетических связей

Выбор видов животных в биологических исследованиях долгое время определялся лишь «удобством» [1]. Удобство в этом контексте включает доступность, круглогодичную фертильность, низкую стоимость и социальную значимость для человека, а также анатомические или физиологические особенности, облегчающие экспериментальные манипуляции и процедуры [2]. Прекрасным примером такого удобного вида является кальмар Loligo forbesii, чьи гигантские аксоны позволили нейрофизиологам делать записи внутриклеточных потенциалов действия нейронов и измерить разность потенциалов между внутренней и внешней стороной мембраны одной клетки, а не на пучке волокон [3–5]. Еще один наиболее яркий пример — работа Ганса Кребса по изучению окислительного метаболизма (цикл лимонной кислоты, цикл Кребса), основанная на исследованиях грудных мышц голубя [6]. Ганс Кребс (1975) объясняет этот выбор устойчивостью митохондрий в этих тканях. Он рассматривает стабильность митохондрий как адаптацию клеток основной летательной мышцы, которая делает их устойчивыми не только к стрессу окружающей среды, но и к экспериментальным процедурам измельчения и суспендирования [5].

Выступая на 13‑м Международном физиологическом конгрессе в Бостоне в августе 1929 г., лауреат Нобелевской премии физиолог Август Крог сказал: «Для решения многих задач будет выбираться какое‑нибудь животное или несколько животных, на которых это будет наиболее удобно изучать». И привел пример со своим учителем Христианом Бором, который, исследуя процесс дыхания, разработал метод изучения обмена с каждым легким в отдельности. Он обнаружил, что у определенного вида черепах есть трахея, разделяющаяся на главные бронхи высоко на шее, а это обеспечивало удобный доступ для экспериментатора. В лаборатории при этом обычно шутили, отмечая, что это животное было создано специально для изучения физиологии дыхания. Август Крог по этому поводу отмечал следующее: «Существует немало животных, которые подобным же образом «созданы» для особых физиологических целей, но боюсь, что большинство из них неизвестны людям, для которых они «созданы», и мы должны обратиться к зоологам, чтобы найти их и взять в свои руки» [2, 5, 7].

Действительно, биологи-экспериментаторы в первой половине ХХ века в исследованиях использовали самые разные виды животных. Однако в 1950‑х годах лабораторные крысы и мыши стали доминирующим видом для поведенческих и физиологических исследований [8, 9].

Профессор Фрэнк Бич в 1950 г. [8] сформулировал проблемы экспериментальных исследований по цитате из стихотворения Льюиса Кэрролла «Охота на Снарка» — «Снарк был Буджумом». Это история 10 невероятных персонажей (исследователей), охотящихся за добычей под названием «Снарк». Хотя такая добыча очень привлекательна, но за нее может быть ошибочно принята особь того же вида «Буджум» с одним лишь отличием: тот, кто встречает Снарка, возвращается домой целым и невредимым, а встретивший Буджума внезапно и бесследно исчезает. Белая крыса выступает в качестве «Снарка», способного предоставить ученым фундаментальную информацию о реакции человека, который в конечном итоге проявит себя как «Буджум», потому что выводы, сделанные на основании данных, полученных на одном экспериментальном виде, не будут транслироваться на другие виды. Таким образом, критика Фрэнка Бича была направлена на скудное число экспериментальных видов, используемых в исследованиях, а также ограниченное количество экспериментальных моделей и исследуемых областей [10].

Такие же проблемы наблюдаются и в области генетики, где используется относительно небольшое число видов [11, 12].

Работа с бактериофагами, грибами (дрожжами) и различными бактериями привела к методам манипулирования геномом и стимулировала развитие молекулярной биологии [11]. Эти новые методы в свою очередь способствовали обширным исследованиям некоторых многоклеточных видов, в частности аскариды Caenorhabditis elegans и рыбки Danio rerio. Все эти «модельные организмы» изначально были выбраны из‑за удобства для экспериментов, особенно вследствие короткого времени воспроизводства ими поколений. Однако по мере того, как вокруг этих видов формировались исследовательские сообщества и начали накапливаться видоспецифические знания, методы и ресурсы, которые в свою очередь стали аргументом для выбора таких видов для исследований [13].

В результате увеличения числа экспериментов с использованием мышей, рыбок Danio rerio, дрозофил, C. elegans и Arabidopsis исследования большинства других видов существенно сократились [14, 15].

Доступные данные о применении животных в Европе хорошо демонстрируют, что наиболее используемыми видами в исследованиях являются грызуны и кролики на протяжении более 50 последних лет — от 77,5 до 86,9%, из них мыши (61%), крысы (12%) и кролики (3,75%). Следующими по востребованности идут хладнокровные животные и рыбы, затем — птицы и парно- и непарнокопытные животные, а реже всего используются хищники и приматы (табл. 1).

Этот анализ, хотя и не включает беспозвоночных и относится только к данным, собранным в Европе, обобщает результаты использования более 9 млн животных каждый год. Имея удивительное биоразнообразие (около 60 тыс. видов позвоночных и 30–50 млн видов беспозвоночных), возможно, имеет смысл пересмотреть вопрос, касающийся применения традиционных модельных видов [5, 19].

Некоторые результаты, полученные на модельных видах, не становятся общебиологическим правилом, как надеялись исследователи, даже если исследование носит молекулярный характер [20].

Если цель исследования состоит в том, чтобы экстраполировать экспериментальные результаты на человека, лучше всего выбрать вид, максимально приближенный к человеку (с учетом бюджета, этических и технических ограничений), при этом не забывая о том, что даже близкородственные виды могут значительно различаться по своим характеристикам. Следует с осторожностью относиться к изучению видов, имеющих короткое время воспроизводства поколений, о которых уже известно, что они быстро эволюционируют, сюда входят и многие из традиционных модельных видов [21].

Межвидовая экстраполяция и трансляционные исследования в последнее время привлекают все больше внимания в области доклинических исследований.

Слово «трансляционный», или Bench-to-bedside (от исследования до пациента), в фундаментальных экспериментах стало своего рода догмой для ученых, чтобы получить финансирование и признание своей деятельности.

Однако все больше работ посвящено проблеме низкой трансляционности доклинических исследований на животных в клинические испытания [22–24]. В 10‑летнем обзоре (1991–2000) I. Kola, J. Landis [22] показали, что суммарный уровень трансляционности во всех терапевтических областях составлял в среднем лишь 11%, еще меньше этот показатель в конкретных областях исследований, таких как онкология или гинекология.

В 2019 г. C.H. Leenaars и соавт. [25] провели масштабный метаанализ по базам PubMed и Embase, в который вошли обзоры с количественным сравнением трансляционных исследований, включающих как минимум два вида, один из которых — человек. Эта работа показала, что трансляционность между токсичностью для животных и человека в тех случаях, когда учитывались все виды животных, составляет 71%, при этом трансляционность для негрызунов была 63%, а для грызунов — 43%.

Такая низкая трансляционность может быть связана с возможными недостатками в клинических испытаниях, неадекватными и предвзятыми данными, полученными от животных, чрезмерно оптимистичными выводами, сделанными из ошибочных исследований на животных, и/или с отсутствием внешней валидности некоторых исследований на моделях с использованием животных [23, 26–29]. Предлагаемый переход от «исследований к пациенту» должен основываться на оценках, включающих различные экспериментальные подходы, при этом разнообразие должно охватывать теоретические соображения, исследуемые экспериментальные виды, лаборатории и модели [30–35].

Сегодня в попытке снизить разрыв между доклиническими и клиническими исследованиями, некоторые новые подходы к биомедицинским экспериментам также направлены на «обратный переход» от клинических результатов к доклиническим исследованиям на животных [36].

В недавней работе R.L. Walker и M. Eggel [37] ставится ключевой вопрос выбора животных для исследования. Если ученые могут заменить использование 10 обезьян на 1000 мышей в поисках эффективного лекарственного средства, должны ли они это делать? Для решения этой задачи авторы уделяют внимание двум аспектам: ответственному проведению исследования (responsible conduct of research — RCR), которое в значительной степени касается соблюдения принципа 3Rs (сокращение, уточнение, замена) и содействию благополучия животных.

Однако обращает на себя внимание недостаточное количество руководств по этическим вопросам выбора животных как экспериментальных моделей.

Широко распространенные принципы 3Rs для исследований на животных были первоначально предложены в середине ХХ века W.M.S. Russell и R.L. Burch [38], которые они опубликовали в своей книге в 1959 г. «Принципы гуманной экспериментальной техники», переизданной в 1992 г. С тех пор эти идеи были приняты регулирующими структурами США и ЕС [39, 40], они стимулируют использование наименьшего количества животных, необходимых для целей науки (сокращение), минимизацию боли и страданий животных при возможности (уточнение) и отказ от экспериментов на животных там, где существуют адекватные альтернативы без использования животных (замена) или относительная (или частичная) замена.

M. Balls [41], сторонник принципов гуманной экспериментальной техники, заметил: «Хотя многие люди заявляют, что привержены концепции сокращения, уточнения и замены 3Rs, предложенной Расселом и Берчем, большинство из них… не читали саму книгу». В результате цели, предложенные авторами, не были достигнуты.

При этом вопрос относительной замены является предметом споров и фактически определяет выбор вида животных [42].

Первоначально [38] под относительным замещением понималось использование животных, которые вероятно или определенно не подвергаются стрессу вообще. Однако в Guide for the Care and Use of Lab Animals под понятием «замена животных» понимается использование животных, стоящих на более низком филогенетическом уровне, вместо более разумных [39]. Остается неясным, относится это определение только к замене позвоночных беспозвоночными животными (некоторые из которых также обладают высокой чувствительностью) или может также определять замену любого животного, находящегося выше по филогенетической шкале, животным, находящимся ниже по шкале, как, например, замена обезьян мышами [42]. При этом филогенетические связи редко или никогда не являются основополагающим фактором при выборе модельных систем, и чаще выбор основан на практичности, что не способствует трансляционности доклинических исследований.

Вся жизнь на Земле является частью единого филогенетического древа, что свидетельствует об общем происхождении видов [43, 44].

Чарльз Дарвин (1859) создал одну из первых иллюстраций и популяризировал понятие «эволюционное древо» в своей книге «Происхождение видов». Сегодня биологи продолжают использовать древовидные диаграммы для изображения эволюции, потому что они эффективно передают концепцию видообразования посредством адаптивного разделения родословных. В корневом филогенетическом древе каждый узел с потомками представляет предполагаемого самого последнего общего предка этих потомков, каждая линия означает существование во времени биологического вида с единым генофондом и разветвляется там, где происходит дивергенция, и возникает репродуктивная изоляция (то есть изоляция между генофондами).

Длина и направление линий бывают либо произвольными, либо привязаны к той или иной системе координат (можно по тем или иным осям откладывать геологическое время, накопление различий или другие параметры). Чаще составляют более обобщенные филогенетические схемы, где каждая линия означает не отдельный вид, а филогенетическую ветвь, состоящую из множества видов. В любом случае каждое разветвление, изображенное на филогенетическом древе, означает дивергенцию, то есть момент, когда один биологический вид разделился на два.

Как же все‑таки принять какую‑то разумную версию выбора животных для исследований, с этой целью надо ответить на несколько вопросов.

Какие из лабораторных животных, находятся «выше» или «ниже» по филогенетической шкале?

Какие особенности делают животных привлекательными для исследователя и почему?

Как соотнести экспериментальные цели и этические нормы?

Модельные организмы выбираются обычно двумя разными способами.

Первый способ — вид выбирается из‑за его уникальных свойств или необычных способностей. Поиск особенностей связан с преднамеренным выбором животных со специализированными системами. Например, в исследованиях нейробиологии специализированные системы кормодобывания или коммуникации — эхолокирующие летучие мыши [45], электрорецептивные рыбы [46] или квакающие лягушки в состоянии «влюбленности» [47]. В токсикологических исследованиях при исследовании орально-диспергируемых лекарственных форм удобно использовать хомячков, обладающих защечными мешками, как будто специально созданными для введения в них лекарственных средств [48, 49].

В рамках дополнительной исследовательской стратегии могут быть выбраны виды, имеющие некоторые характеристики, аналогичные особым способностям человека, независимо от филогенетического родства, например, цветовое зрение [50], распознавание лиц [51] или голосовая коммуникация [52].

Второй способ заключается в использовании общих биологических черт [53] и основан на относительной простоте изучаемых организмов. Например, при изучении нервной системы выделяют три типа нервной системы, возникших независимо друг от друга:
1) Mollusca (брюхоногие — морской моллюск Aplysia и головоногие);
2) Arthropoda, членистоногие (ракообразные — Limulus и многочисленные насекомые, включая дрозофилу);
3) Chordata, хордовые [немлекопитающие позвоночные — рыбы Danio rerio и зебровый зяблик Taeniopygia guttata, а также млекопитающие, включая мышь (Mus musculus), крысу (Rattus rattus) и макаку-резус (Macaca mulatta)].

Эти три типа разошлись более 450 млн лет назад, в кембрии или раньше, их общие предки имели минимальную нервную систему, но фундаментальные особенности физиологии нейронов являются для них общими. Именно общие черты оправдывают выбор этих видов, которые изначально использовали, опираясь на принцип доступности и простоты лабораторного обслуживания [53–55]. Приматы от лемуров до шимпанзе являются объектами исследования прежде всего из‑за их филогенетической близости к людям, а не вследствие удобства их обслуживания в лаборатории.

В целом эволюционная биология предлагает руководство для выбора моделей и интерпретации результатов в конкретном контексте трансляционных исследований, а также может помочь в поиске нетрадиционных моделей, имеющих уникальные преимущества в использовании при решении конкретных исследовательских вопросов [56–59].

Для оценки потенциальной полезности вида в качестве модели требуется знать, каково его расположение на филогенетическом древе, а также какие признаки мы хотим изучить [56, 58, 60, 61]. Эти сведения позволяют оценить, на каком таксономическом уровне можно искать нужный вид животных, и предоставляют информацию о том, какие другие виды с такими же признаками могут быть использованы.

В тех случаях, когда интересующие признаки, свойственные человеку, характерны и для некоторых видов животных, тогда эти виды могут быть ценным экспериментальным объектом. В то же время нельзя смешивать ценность модели для изучения общих механизмов (конструктивная или структурная валидность) с ее способностью давать результаты, которые можно будет непосредственно применить в клинической практике (прогностическая валидность) [26, 30, 32].

Ценность каждой модели определяется как ее научным, так и эволюционным контекстом. Филогенетические древа обеспечивают такой контекст, не только выделяя фенотипические различия и сходства, но и позволяя сделать выводы об источнике сходства. Понимание, что эволюция наделила разные виды сходными чертами, имеет отношение как к первоначальному выбору модели для изучения конкретного вопроса, так и к интерпретации результатов. Сегодня выделяют два эволюционных пути, обеспечивающих сходство признаков.

Во-первых, это общее происхождение, или гомология, в этом случае можно ожидать большего сродства для близких филогенетических родственников, а также идентичность дополнительных признаков, которые имеют общее происхождение, и сделать более конкретный вывод о близких родственниках.

Гомология — признаки, сходные между собой по происхождению, строению, но выполняющие разные функции, являющиеся результатом девергенции (расхождение признаков в результате естественного отбора может происходить из‑за смены условий окружающей среды).

Во-вторых, влияние окружающей среды, ведущее к конвергенции. При этом различие между гомологией и конвергенцией не всегда очевидно и даже не всегда бинарно [62, 63]. На этом основании можно ожидать большего сходства не только у таксонов, подверженных аналогичному избирательному влиянию окружающей среды, но и дополнительных признаков с родственной адаптивной функцией, вывод в этом случае можно сделать без учета родственных связей.

Конвергенция — сближение признаков в ходе эволюции у неродственных групп, развивающихся в одинаковых условиях окружающей среды.

Таким образом, в результате дивергенции видов предполагаемая «терапевтическая мишень», идентифицированная у модельного вида животных, может быть неэффективна у пациентов-людей.

Причинами такого отсутствия трансляции могут быть:

• относительно короткая продолжительность жизни у грызунов (как наиболее часто используемых экспериментальных животных);
• небольшой размер тела по сравнению с человеком;
• специфическая стандартная диета (лабораторные корма);
• геномные отличия от человека;
• значительные различия в развитии и функционировании органов и систем (не всегда хорошо изученные).

Каждая из этих причин или их совокупность может привести к плохой имитации патогенеза заболеваний у человека [58, 64].

Важно включать в исследования виды, которые развиваются и размножаются не так быстро, как традиционные модельные виды, потому что многие характеристики, общие для традиционных моделей, могут оказаться конвергентными адаптациями к быстрому развитию, а не исходными свойствами [21].

Можно нивелировать эту проблему, протестировав методы лечения на нескольких видах животных (в идеале, включая нечеловекообразных приматов) до начала клинических испытаний, но это дорого обходится и оставляет открытой возможность того, что биология человека отличается от таковой у экспериментальных видов в одной или более критических точках. Поэтому рекомендуется сравнить результаты, полученные на нескольких видах экспериментальных животных, прежде чем предполагать, что они будут хорошо транслироваться на людей [20, 23, 65].

Эти проблемы подчеркиваются рядом исследований, показывающих, например, что некоторые методы лечения, испытанные на мужчинах, менее или неэффективны для женщин [66] или мутации в генах, связанных с болезнью, неодинаково проявляются у разных людей, даже при таких моногенных заболеваниях, как фенилкетонурия [67]. Общая проблема заключается в том, что функции многих генов зависят от контекста [68] и поэтому могут различаться у разных людей, полов и видов.

Признаки каждого вида отражают как его происхождение, так и адаптивные изменения под влиянием окружающей среды [69]. Естественный отбор формирует признаки, повышающие приспособленность к данной среде, и включает функциональное поведение [32, 70], сенсорные системы [24, 71], вариации структуры мозга, связанные с разнообразными местами обитания и образом жизни [72]. Биоразнообразие, сопряженное с естественным отбором, предлагает широкий спектр животных, потенциальных моделей для научных целей. Однако кроме этого, биоразнообразие наблюдается и в среде, созданной человеком, с набором факторов, влияющих на эволюционные траектории многих комменсальных и/или одомашненных видов животных [58, 73]. Как только эти животные достигают статуса экспериментальных, возникает дополнительное (и часто чрезвычайно жесткое) влияние окружающей среды, связанное с их новой ролью, что ускоряет их эволюцию в определенных направлениях. Этот процесс наиболее выражен и хорошо изучен для грызунов, поскольку они имеют долгую историю адаптации к проживанию рядом с человеком — от комменсализма до международного лабораторного использования мышей (современное «промышленное получение грызунов») [5, 9, 74–76].

Мыши в процессе эволюции приобрели определенные признаки в дикой природе, однако это не означает, что лабораторные мыши обязательно будут обладать этими признаками. Еще до того, как люди начали преднамеренно отбирать или размножать животных по определенным признакам, происходил сильный естественный отбор, осуществляемый в среде новой лаборатории или исследовательской колонии. Как выразился B.L. Finlay [53], происходила «лабораторизация» животного в стерильной и неизменной среде. Лабораторные условия, включая абиотические факторы — свет и температуру, и биотические — угрозу со стороны хищников или социальный контекст, могут существенно повлиять на биологию вида.

Так показано, что изменения у лабораторных мышей могут включать резкие сдвиги в фенотипе, поведении [32, 70], популяционной генетике [77], иммунной функции [78, 79], метаболизме, физиологии и др. [24, 80].

Стандартизированное жилье для грызунов резко ограничивает как физическую, так и социальную сложность окружающей среды животного с хорошо известными эффектами на развитие мозга и поведение [81, 82]. Другим примером является воздействие (или его отсутствие) иных видов, например инфекционных агентов [78, 79]. Растет количество доказательств наличия связей между иммунной системой, микробиомом и нервной системой [83–86]. Следует обратить внимание, что нереалистично упрощенные модели, такие как грызуны, свободные от патогенов (SPF), могут дать ряд ошибочных наблюдений и выводов.

Так, в работе S.P. Rosshart и соавт. [36] в двух доклинических исследованиях было показано, что мыши с естественной микробиотой лучше копируют иммунные реакции человека, и исследования на этих животных имеют более высокую воспроизводимость в клинических исследованиях, чем животные с SPF-статусом.

Несмотря на то, что ученый рассматривает экспериментальных животных как инструмент для достижения научных целей, необходимо помнить, что лабораторные животные остаются биологическими организмами. В связи с этим межвидовые различия, развивающиеся в результате адаптации к изменяющейся среде обитания, образу жизни в лаборатории (виварии, питомнике), и отсутствие гарантии сходства между экспериментальным видом и целью исследования могут оказать влияние на трансляционность результатов [26, 30, 70]. Необходимо учитывать видоспецифические физиологические потребности животных в лаборатории как для их благополучия, так и для поддержки проявления ими нормальных фенотипов. Существенным для этих физиологических потребностей является их эволюционное развитие [58]. Грызуны как экспериментальные животные доминируют в биомедицинских исследованиях, при этом они претерпели примерно 73 млн лет независимой эволюции с момента нашего последнего общего предка, в то время как линии шимпанзе и человека разошлись около 7 млн лет назад [87]. Эта долгая отдельная филогения привела к глубоким различиям, однако исследователи склонны подчеркивать сходство, игнорируя различия.

Сегодня выбор модельных видов включает обычно два предположения:
1) сходство между видами неуклонно уменьшается с увеличением филогенетического расстояния;
2) больше сходства на более низких уровнях биологической организации.

Понимание филогенетического положения и эволюционной истории конкретного вида может помочь определить, какие аспекты его биологии, вероятно, являются репрезентативными для высших таксонов. В доклинические исследования зачастую вовлечены специалисты разных специальностей, при этом выбор животных для экспериментов, а также реализация принципа относительной замены на основе филогенетической шкалы не всегда очевидны для исследователя. Кроме того, в рутинных испытаниях каждый раз осуществлять углубленный филогенетический анализ не всегда целесообразно. Поэтому мы предприняли попытку систематизировать наиболее часто используемые виды лабораторных животных в зависимости от их таксономического уровня в таблице, в надежде, что она поможет исследователю провести первичный анализ и подобрать вид животных для своего исследования (табл. 2).

Конечно, выбор экспериментального вида не должен основываться только на филогенетических связях. Определенный набор признаков каждого вида помогает определить, как и для чего он может работать в качестве модели, а также для каких научных целей эта модель может быть значима [5]. Модельный организм должен:

• соответствовать целевому организму (человеку) в отношении рассматриваемого признака — прямое сходство;
• предложить экспериментальный доступ к интересующему признаку или органу, например, как в случае с черепахами, использованными Христианом Бором;
• обладать признаками, противоположными целевому организму. Например, по сравнению с людьми мыши значительно более устойчивы к бактериальным эндотоксинам, вызывающим сепсис [95, 96], это несоответствие ограничивает их ценность в качестве суррогатных моделей сепсиса у людей [96–98], но изучение биологической основы устойчивости мышей к сепсису или устойчивости землекопов к неопластическим процессам [99] может быть полезно для лечения этих заболеваний.

Изучая филогению каждого вида, можно получить важную информацию о взаимоотношениях, распределении признаков и происхождении сходств или различий.

По мнению J.A. Bolker [100], при выборе экспериментального вида животных необходимо сосредоточить внимание на нескольких вопросах (табл. 3).

Что поможет избежать ошибок:
1) точность формулировки с указанием, как признаки и результаты, которые будут оценены у экспериментальных животных, соотносятся с проявлениями у человека, на которые мы хотим воздействовать [13, 32–34, 101];
2) оценка филогенетического положения, которое может дать информацию о том, какие виды с наибольшей вероятностью дадут трансляционные знания о биологии человека, поскольку единого правильного ответа или «лучшего» экспериментального животного не существует, необходимо использовать несколько параллельных подходов:

• продолжать изучать «основные» экспериментальные виды;
• включать большее разнообразие экспериментальных видов [102, 103];
• использовать новые нетрадиционные экспериментальные виды, обладающие уникальными преимуществами, для конкретных исследований [104, 105].