Вариабельность биохимических показателей крови и установление референтных интервалов в доклинических исследованиях. Сообщение 6: яванские макаки

Введение

Одним из наиболее широко используемых видов приматов (nonhuman primates) в биомедицинских исследованиях являются обезьяны, принадлежащие к подсемейству Cercopithecinae, обезьяна cynomolgus, или яванский макак (Macaca fascicularis, макака-крабоед) [1]. Одна из основных причин применения данного вида животных в доклинических исследованиях заключается в генетической близости людей и Macaca fascicularis, они имеют общее происхождение с людьми, при этом их геном примерно на 90% идентичен геному человека [2]. Данный вид играет важную роль в проведении заключительных этапов доклинических исследований в ходе изучения вакцин, разработке фармацевтических препаратов и токсикологических исследованиях [3]. Генетическая близость предполагает тот факт, что яванские макаки обладают схожими механизмами этиопатогенеза определенных заболеваний и действиями химических веществ на организм [4]. Ферменты семейства цитохрома P-450 Macaca fascicularis высоко гомологичны с их человеческими аналогами (1A1, 1A2, 2B6, 2C8, 2C18, 2E1, 3A5 и др.), что в свою очередь может свидетельствовать о схожей биотрансформации лекарственных веществ двух видов [6]. Трансгенные и нокаутированные лабораторные животные, например мыши, могут быть высокоинформативными в отношении эффектов отдельных генов или комбинаций нескольких генов, но они не могут адекватно и в полной мере моделировать комплекс взаимодействий генетической информации и окружающей среды в отличие от приматов [7].

Яванские макаки являются широко используемым видом в биомедицинских исследованиях благодаря нескольким важным преимуществам. Данные животные обладают оптимальными размерами тела. Результаты на приматах признаны наиболее надежными в сравнении с другими моделями животных (грызунами, собаками и свиньями) по анатомическим, физиологическим и эндокринологическим особенностям [8]. Они подвержены возрастным патологиям, характерным для человека [9], естественным образом восприимчивы к множеству серьезных заболеваний, наблюдаемых у людей, — это сердечно-сосудистые заболевания [10], поведенческие нарушения [11], болезнь Альцгеймера [12], ожирение [13], сахарный диабет 2‑го типа [14]. Различные вирусы иммунодефицита обезьян (SIVs1), аналоги ВИЧ могут инфицировать яванских макак и вызывать спидоподобный синдром [15, 16]. Данная восприимчивость к вирусам неоднократно использовалась в доклинических исследованиях на приматах для изучения этиологии и лечения полиомиелита, кори, гепатитов (А, В, С, Е), вируса Эбола, COVID-19 [17–21]. Среди бактериальных агентов яванские макаки восприимчивы к Helicobacter pylori, Mycoplasma, Mycobacterium tuberculosis [22–24], что в очередной раз подтверждает перспективность использования рассматриваемого вида приматов в доклинических экспериментах. Macaca fascicularis также широко используются в качестве животных моделей для алло- и ксенотрансплантации [25, 26], которые направлены на решение проблемы постоянно растущей нехватки донорских органов для человека. Приматы являются предпочтительным видом для исследований репродуктивной системы. Менструальный цикл и эндокринологические особенности аналогичны таковым у женщин, существует сильное сходство между самцами яванских макак и мужчинами с точки зрения эндокринного контроля функции яичек (фолликулостимулирующий гормон, ингибин В), анатомии и контроля функции предстательной железы [27–30]. Яванские макаки являются хорошими моделями для разработки лекарств местного применения, например, в офтальмологии или при создании ингаляционных форм тестируемых средств [31, 32].

Широкое и повсеместное применение данных приматов в доклинических исследованиях указывает на необходимость контроля состояния здоровья животных. Для создания интегрированной высококачественной основы для будущих исследований на яванских макаках необходимо иметь всесторонние и точные эталонные значения лабораторных показателей данного вида животных.

Цель работы — создание базы референтных значений некоторых биохимических показателей крови Macaca fascicularis. Данные показатели важны в доклинических исследованиях при оценке состояния здоровья животных, для повышения точности анализа и при интерпретации полученных значений, а также для определения безопасности лекарственных средств. Референтные значения, полученные в этом исследовании, могут быть использованы в качестве исходных данных для анализа биохимических показателей крови яванских макак, используемых в доклинических исследованиях.

Материал и методы

Для формирования референтных интервалов (РИ) использовали данные, полученные от интактных животных в декабре 2021 г., январе 2022 г. в АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ». Все проведенные эксперименты были одобрены биоэтической комиссией. Анализу подлежали результаты, полученные от 52 самцов и 21 самки (небеременные и нерожавшие, без учета фазы менструального цикла). Возраст самцов и самок яванских макак составлял 4–6 лет, масса тела самок и самцов — 4–6 кг. Животных содержали в одинаковых стандартных условиях вивария: температура воздуха 22–26 °С, относительная влажность 40–75%, 12‑часовой световой день. Кормление животных проводили в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях. Исследование выполнено с соблюдением принципов Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов и других научных целей (Страсбург, 1986), и в соответствии с правилами надлежащей лабораторной практики. Определение биохимических показателей для всех животных проводили в одинаковых условиях с применением общепринятых аналитических методов. Для исследования использовали кровь, которую отбирали из бедренной вены яванских макак натощак без седации и анестезии в вакуумные пластиковые пробирки (ООО «КОРВЕЙ», Россия). Для получения сыворотки кровь центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин на центрифуге ОПн-3.04 Дастан (Киргизия). Полученную сыворотку переносили в стерильные пробирки, в которых определяли биохимические показатели. В сыворотке крови животных на автоматическом биохимическом анализаторе Rendom Access A-25 (BioSystems, Испания) с использованием соответствующих наборов регистрировали следующие показатели: креатинин, мочевина, аланинаминотрансфераза (АЛТ), аспартатаминотрансфераза (АСТ), щелочная фосфатаза, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глюкоза, креатинкиназа, лактатдегидрогеназа (ЛДГ) и общий билирубин. Концентрацию общего билирубина определяли с помощью набора реактивов (Вектор-Бест, Россия), для установления уровня остальных аналитов использовали биохимические наборы (BioSystems, Испания). Статистическую обработку осуществляли с использованием пакета программ GraphPad Prism 9.0 (США), статистические выбросы оценивали с помощью метода Тьюки, вид распределения определяли, применяя критерий Шапиро–Уилка, парные сравнения между животными разного пола — U-критерий Манна–Уитни и t-критерий Стьюдента.

Результаты и обсуждение

Для устранения влияния аномальных значений из массива данных в расчет не принимали статистические выбросы, которые определяли отдельно для каждого показателя и пола животных по методу Тьюки [33]. Из дальнейшей работы были исключены не только такие значения, как «extremes», или жесткие выбросы, и «outliers» — мягкие выбросы, но и данные, лежащие за пределами интервала Q3 и Q1 (1‑го и 3‑го квартилей). Межквартильный интервал IQR вычисляли как Q3–Q1. Верхний и нижний пределы рассчитывали следующим образом:

Q1–1,5IQR и Q3+1,5IQR.

Данные о доле статистических выбросов по каждому показателю и выходящие за пределы РИ представлены в табл. 1.

Наиболее частые статистические выбросы при анализе сыворотки крови яванских макак отмечали в отношении общего билирубина (12,5%) у самок, а также триглицеридов (8,9%) и креатинкиназы (10,3%) у самцов. РИ для полученных результатов в зависимости от вида их распределения рассчитывали следующим образом:

Хср.±1,96SD — для нормального распределения;

2,5–97,5 процентили (‰) — для ненормального распределения (табл. 2).

Вид распределения определяли по критерию Шапиро–Уилка. Дополнительно проводили парное сравнение между животными разного пола методами непараметрической статистики для ненормального распределения (U-критерий Манна–Уитни) и параметрической статистики для нормально распределенных данных (t-критерий Стьюдента). В табл. 2 представлены результаты РИ биохимических показателей крови яванских макак. Полученные диапазоны значений самцов и самок соотносятся между собой по таким параметрам, как креатинин, мочевина, АСТ, АЛТ, холестерин, триглицериды, общий белок, альбумин, глобулины, соотношение альбумин/глобулины, глюкоза, ЛДГ и креатинкиназа. Исключение составляет щелочная фосфатаза — референтный диапазон рассматриваемого показателя у самцов был значительно шире. Отчасти это может быть связано с тем, что менструальный цикл у самок влияет на показатели химического состава их сыворотки [34].

РИ в доклинических исследованиях играют важную роль для оценки состояния здоровья, физиологических изменений, диагностики заболеваний и принятия решений о необходимости лечения лабораторных животных. Многие заболевания (сахарный диабет, атеросклероз) влекут за собой биохимические изменения не одного определенного показателя, а некоторой совокупности показателей, что свидетельствует о необходимости комплексной интерпретации полученных данных. С другой стороны, небольшие отклонения за пределы РИ могут и не иметь клинического значения, так как показатели здоровых животных могут быть слегка со сниженными или повышенными значениями исследуемого параметра по сравнению с контрольным интервалом, но на самом деле определяемые уровни для этого животного являются нормальными. Понимание широты этого диапазона интересующего показателя у определенного вида лабораторного животного и способность интерпретировать «выход» за пределы рассчитанного РИ являются важной составляющей доклинического эксперимента. Биохимические показатели яванских макак схожи с таковыми человека, но имеют и свои определенные особенности, которые необходимо учитывать при оценке полученных данных.

У яванских макак самый высокий уровень активности АСТ определяется в сердечной мышце, а к органам с относительно высокой активностью данного фермента относятся печень, скелетные мышцы, почки и головной мозг. Наибольшая активность АЛТ определяется в печени, хотя сердечная мышца и почки также содержат значительное количество данного фермента. У приматов повышенный уровень АЛТ не так специфичен при повреждениях печени, как у других лабораторных животных — собак, крыс или мышей. К патологическому повышению АЛТ могут привести и повреждения мышц. У яванских макак после анестезии, введения внутривенных веществ и забора крови может наблюдаться легкое или умеренное повышение уровня активности печеночных ферментов [35, 36], не связанное с каким‑либо заболеванием.

Чувствительность щелочной фосфатазы как индикатора холестаза и заболеваний желчевыводящих путей у Macaca fascicularis значительно ниже, чем у многих других лабораторных животных, например у собак. К тому же нормальный диапазон активности фермента может достигать высоких значений, а уровень активности у отдельных животных значительно меняться как с периодом день–ночь, так и с возрастными особенностями [37].

Концентрация глюкозы в сыворотке крови натощак обычно у макак ниже, чем у других лабораторных животных, но высвобождение катехоламинов во время процедуры сбора крови может привести к высоким концентрациям, достаточным, чтобы спутать этот факт с сахарным диабетом. Умирающие животные могут иметь очень высокие или очень низкие концентрации глюкозы [37, 39].

Для рассматриваемых приматов характерен широкий и высокий диапазон общего белка и глобулинов (примерно 90 и 50 г/л соответственно) по сравнению с другими лабораторными животными. Этиология такого состояния обычно считается субклиническим воспалительным или инфекционным заболеванием, которое необходимо рассматривать в контексте определенного случая. Альбумин у яванских макак может выступать индикатором общего состояния здоровья. Например, у голодающих животных с задержкой роста или имеющих признаки желудочно-кишечного расстройства часто регистрируются низкие концентрации данной фракции белка. В исследованиях снижение уровня альбумина и повышение содержания глобулина являются частым следствием воспаления, также данная картина наблюдается при длительном проведении внутривенных вливаний с применением катетера [38].

Уровень холестерина, триглицеридов и липопротеинов тщательно изучался у приматов особенно в отношении моделей дислипопротеинемии и атеросклероза. Липидный профиль яванских макак сопоставим с таковым у человека с аналогичным количеством липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и небольшим количеством липопротеина очень низкой плотности. Сыворотка Macaca fascicularis часто имеет высокие уровни триглицеридов без видимых признаков липемии. Одной из причин этого является увеличение свободного глицерина в сыворотке — повышенный уровень адреналина при стрессовых ситуациях активирует гормон-чувствительную липазу, что приводит к высвобождению глицерина в кровоток [40, 41].

Основная причина повышенного содержания креатинкиназы в сыворотке крови у яванских макак — повреждение скелетных мышц. Активность креатинкиназы и ее изоферментов наряду с сердечным тропонином I и натрийуретическим пептидом головного мозга используют для оценки повреждения миокарда. Изомеры креатинкиназы у яванских макак аналогичны человеческим: CK-BB (мозговой изофермент, отражающий патологию клеток головного мозга) почти полностью содержится в головном мозге, CK-MM (мышечный изофермент, находящийся в скелетных мышцах) — в скелетных и сердечных мышцах, CK-MB (по названию субъединиц молекулы; сердечный изофермент, изменяющийся при повреждении клеток миокарда) — в первую очередь в сердечной мышце, но встречается также в скелетных мышцах. Стоит отметить, что определение активности креатинкиназы само по себе недостаточно специфично или чувствительно, чтобы надежно указывать на сердечную патологию. Существуют исследования, где совокупность показателей креатинкиназы, АСТ, соотношения креатинкиназа/АСТ, ЛДГ и протеинурии позволяют обеспечить способ диагностики клинической и/или субклинической кардиомиопатии [37, 42, 43].

У яванских макак так же, как и у человека, 5 изоферментов ЛДГ. Изоферменты 1–3 являются наиболее распространенными, их активность повышена в миокарде, почках, головном мозге и эритроцитах. У приматов были задокументированы значительные ежедневные и суточные колебания данного фермента. Стресс, физические нагрузки, анестезия могут вызвать повышение уровня ЛДГ. Данный показатель используется в доклинических исследованиях для диагностики инфаркта миокарда у яванских макак, застойной сердечной недостаточности и других болезней сердца [44].

В табл. 3 на основании источников литературы представлены данные биохимических показателей крови Macaca fascicularis и человека. Был проведен перерасчет показателей, представленных в традиционных единицах, в единицы системы СИ [45].

При сравнении РИ, полученных в АО «НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», с указанными в источниках литературы у яванских макак установлено, что в целом диапазоны рассматриваемых показателей схожи, но присутствуют и различия. Значения АСТ, АЛТ, холестерина, триглицеридов, общего белка, альбумина, глобулинов, соотношения альбумин/глобулина, глюкозы, общего билирубина и ЛДГ соответствуют таковым в литературе. Полученный диапазон креатинкиназы оказался более узким в сравнении с опубликованными данными. РИ щелочной фосфатазы согласуются с результатами в источниках литературы, а более широкий диапазон у самцов, чем у самок, также прослеживается и в научной литературе, что подтверждает их достоверность.

Сопоставляя полученные биохимические показатели крови яванских макак и соответствующие данные человека (см. табл. 3), можно сделать вывод, что большинство рассматриваемых показателей, а именно креатинин, мочевина, АСТ, АЛТ, общий холестерин, триглицериды, общий белок, альбумины, глобулины и соотношение альбумин/глобулина, максимально приближены к нормам, установленным для людей. Референтные значения щелочной фосфатазы и креатинкиназы яванских макак имеют значительно более широкие диапазоны по сравнению с таковыми у человека. Показатели активности ЛДГ оказались выше человеческих. Эту информацию необходимо учитывать при моделировании патологических процессов в доклинических экспериментах и анализе данных.

Полученные референтные диапазоны в совокупности с генетической близостью яванских макак и человека указывают на важность использования данного вида приматов в качестве тест-системы в доклинических исследованиях. Действительно, большое количество патологических состояний, моделируемых на яванских макаках, демонстрирует схожие с человеком клинические симптомы, гистологические изменения, а также изменения в биохимическом профиле крови. В табл. 4 представлены краткие данные литературы некоторых похожих патологических состояний яванских макак и человека, сопровождающихся повышенным или пониженным содержанием того или иного биохимического показателя.

Например, острый и хронический панкреатит у Macaca fascicularis напоминает таковой у человека и хорошо поддается моделированию. Со стороны биохимических изменений наблюдаются повышенные уровни глюкозы в крови, ферментов поджелудочной железы, амилазы и липазы, а также гипоальбуминемия и потеря белка [46, 47].

Яванские макаки являются одними из наиболее часто используемых животных в доклинических исследованиях для моделирования сахарного диабета 2‑го типа. При диете с высоким содержанием жиров/углеводов у этих животных постепенно развиваются ожирение и резистентность к инсулину, что в свою очередь приводит к нарушению толерантности к глюкозе. Патофизиологический процесс, посредством которого прекращается секреция инсулина, имитирует состояние человека. Первоначально островки поджелудочной железы становятся гиперцеллюлярными, поскольку бета-клетки вырабатывают все большее количество инсулина в ответ на гипергликемию. Патологическое состояние сопровождается повышением уровня общего холестерина и триглицеридов в плазме крови. Кроме того, обнаружены высокие уровни сывороточных гликированных белков (например, HbA1) и фруктозамина [14, 48, 49].

В научной литературе широко освещены модели атеросклероза на яванских макаках, которые используются для выяснения многих механизмов и особенностей заболевания, ввиду того что патогенез и реакция на лечение напоминают состояние человека. Как и у людей, наблюдается увеличение концентрации общего холестерина — повышение ЛПНП и снижение ЛПВП в сыворотке крови. Распределение атером схоже с таковым у человека — бляшки образуются в точках разветвления средних и крупных артерий, таких как коронарные и сонные. Гистопатологически в фиброзно-жировых поражениях определяются обильные пенистые макрофаги и лимфоциты, отражающие воспалительную природу заболевания [40, 50].

Ввиду физиологической близости яванские макаки подходят для изучения патогенеза и лечения COVID-19 [51]. В исследованиях были показаны высокие уровни репликации вируса через 7–14 дней, поражение верхних и нижних дыхательных путей и диффузное повреждение альвеол, аналогичное человеческому [52]. В зависимости от тяжести заболевания регистрировалось повышение уровня креатинина, АСТ, АЛТ, общего билирубина, ЛДГ и креатинкиназы в сыворотке крови, а также снижение общего белка и альбумина [52].

Для каждого показателя были рассчитаны коэффициенты вариации, что в грубом приближении соответствует межиндивидуальной вариабельности этих показателей в человеческой популяции. В широком смысле под этим определением подразумевается изменчивость качественных и/или количественных особенностей структуры и/или функций, присущих двум и более отдельным (индивидуальным) животным. Сравнительные данные приведены в табл. 5.

Схожая вариабельность у яванских макак и человека отмечена по показателям АСТ, АЛТ, общий белок, триглицериды, общий билирубин, креатинкиназа, щелочная фосфатаза. Различия присутствуют среди показателей мочевины, холестерина, альбумина, глюкозы и ЛДГ. Рассматриваемые данные имеют более широкую вариабельность у яванских макак в отличие от человека. Данную информацию необходимо учитывать при интерпретации полученных значений в доклинических исследованиях.

Заключение

Яванские макаки ввиду тесной филогенетической связи с человеком являются важной моделью в доклинических исследованиях, направленных на изучение новых химических средств и вакцин. Проведенное исследование позволило установить некоторые биохимические показатели для клинически здоровых животных. Полученные диапазоны значений у самцов и самок соотносятся между собой по большому количеству рассматриваемых параметров, исключение составляет щелочная фосфатаза, чей диапазон оказался шире у самцов, чем у самок. Было показано, что полученные референтные интервалы схожи с таковыми в источниках литературы, что подтверждает их достоверность. Сравнительный анализ межиндивидуальной вариабельности биохимических показателей крови яванских макак и человека демонстрирует наличие некоторых видовых различий, которые необходимо учитывать в экспериментальной деятельности.