Оценка использования различных формул коррекции интервала QT (QTc) и референтные интервалы ЭКГ у наркотизированных собак породы бигль

Введение

Неотъемлемой частью программы доклинической оценки лекарственных препаратов является изучение их фармакологической безопасности в отношении функций основных систем органов. Цель таких исследований — выявление нежелательных фармакодинамических свойств действующего вещества, которые могут оказаться значимыми для безопасности человека. Прежде всего необходимо оценить влияние препарата на функцию жизненно важных систем. К ним относятся сердечно-сосудистая система (ССС), дыхательная и центральная нервная системы [1].

Комплексная оценка влияния на ССС предусматривает проведение исследований как in vitro, так и in vivo. При оценке влияния исследуемого действующего вещества на ССС в исследованиях in vivo необходимо оценить его действие на артериальное давление (АД), частоту сердечных сокращений (ЧСС) и параметры электрокардиограммы (ЭКГ) [1]. Эти исследования могут проводиться у животных в сознании или под наркозом [2–4].

В руководстве ICH S7B описывается стратегия доклинических исследований для оценки способности исследуемого вещества задерживать реполяризацию желудочков. Интервал QT (время от начала комплекса QRS до окончания зубца Т) на ЭКГ является мерой продолжительности деполяризации и реполяризации желудочков. Удлинение интервала QT может быть врожденным или приобретенным (например, при приеме лекарственных препаратов). На сегодняшний день считается, что при задержке реполяризации желудочков и удлинении интервала QT существует повышенный риск развития желудочковой тахиаритмии, включая желудочковую тахикардию типа «пируэт» (torsades de pointes), особенно в сочетании с другими факторами риска (например, гипокалиемией, структурным заболеванием сердца, брадикардией). Точная связь между вызванной тестируемым веществом задержкой реполяризации желудочков и риском развития аритмии неизвестна [2]. Удлинение интервала QT не является высокоспецифичным маркером, тем не менее считается, что препараты, которые не вызывают даже незначительного удлинения интервала QT, вероятней всего, не будут вызывать желудочковую тахикардию вовсе, либо этот эффект будет наблюдаться крайне редко при клиническом применении [3]. Соответственно, на сегодняшний день ввиду отсутствия других более информативных подходов оценка влияния лекарственных кандидатов на продолжительность QT и другие параметры ЭКГ является неотъемлемой частью исследований по изучению фармакологической безопасности.

Рекомендуемые виды лабораторных животных для электрофизиологических исследований in vivo — это собаки, обезьяны, свиньи, кролики, хорьки и морские свинки [2–6].

Собаки широко используются в токсикологических исследованиях и при определении фармакологической безопасности в отношении ССС благодаря сходству проводящей системы сердца с таковой у человека. Кроме того, эксперименты с участием собак подтвердили наличие определенной связи между эффектом от приема лекарственных препаратов, удлиняющих интервал QT, и повышенной вероятностью развития желудочковой тахикардии и внезапной смерти [4].

Интервал QT укорачивается при увеличении ЧСС и удлиняется при уменьшении [7]. Данное обстоятельство может затруднить оценку потенциального влияния тестируемого вещества на реполяризацию желудочков и интервал QT при различной ЧСС у животных [2].

Поскольку интервал QT зависит от ЧСС, его необходимо корректировать. Формула корректировки QTc (скорректированный QT) определяет интервал QT при ЧСС 60 в минуту. Это позволяет проводить сравнение значений интервала QT за определенный промежуток времени при различной ЧСС [7]. Было предложено несколько подходов к нормализации QT в зависимости от ЧСС (QTc), при этом вопрос о применимости различных формул остается предметом дискуссий. Существует ряд математических возможностей для описания соотношения QT–RR, но часто используются только довольно простые подходы к коррекции ЧСС, несмотря на их очевидные ограничения. Наиболее распространенные подходы — это использование формул Базетта (Bazett) и Фридерика (Fridericia). Эти формулы, а также другие однокоэффициентные модели не могут описать функциональную связь QT и RR у собак, так как у них ЧСС имеет широкий диапазон. Исследования показали, что использование данных формул не всегда корректно, так как результаты сильно различаются в зависимости от того, была ли ЧСС низкой или высокой. Выбор формулы коррекции ЧСС должен быть обусловлен особенностями тест-системы. У собак использование этого подхода осложняется тем, что в отличие от людей для них характерны дыхательная синусовая аритмия, а также существенные вариации ЧСС в зависимости от эмоционального и физического состояния животного, поэтому QT–RR выравнивается (влияние ЧСС на изменение QT уменьшается) только при низкой ЧСС у собак [8, 9].

В некоторых исследованиях на собаках, в которых анализировались большие массивы данных (n=177), отмечалось, что размер группы из 4–8 животных может с вероятностью 80% обнаружить изменение на 10% и 5% соответственно в надлежащим образом скорректированном интервале QT. Однако для этого требуется предварительный подбор корректирующей формулы, учитывающий условия проведения экспериментов в каждом исследовательском учреждении [10].

Принимая к сведению необходимость подбора поправочных формул для оценки интервала QT, а также зависимость параметров ЭКГ от большого числа факторов, в каждой лаборатории должен быть разработан подход с использованием собственных данных, полученных на конкретной породе собак и при определенных экспериментальных условиях с учетом всех факторов, потенциально влияющих на результаты (циркадные ритмы, используемое оборудование, анализируемые отведения, наркотизация и др.). С этой целью проанализировали данные ЭКГ и АД, полученные от 42 половозрелых собак породы бигль самцов и самок в течение 2021 г., и рассчитали референтные интервалы по основным показателям, а также применили и сравнили различные подходы коррекции QT применительно к имеющимся данным. ЭКГ регистрировали на наркотизированных животных.

Материал и методы

В экспериментах использовали 25 самцов и 17 самок собак породы бигль массой 8,3–15,8 кг для самцов и 9,9–13,0 кг для самок. Животных содержали в стандартных условиях вивария: температура воздуха 15–21 °С, 12‑часовой световой день. Собаки находились в стандартных вольерах, не более 5 животных в каждом. Площадь пола на одно животное соответствовала регламентирующим стандартам, доступ к воде не ограничивали на протяжении всего срока эксперимента. Животных лишали корма на ночь перед экспериментальными манипуляциями, оставляя свободный доступ к воде. В кормлении животных использовали стандартную диету. Все научно-исследовательские работы были рассмотрены на биоэтической комиссии АО НПО «ДОМ ФАРМАЦИИ», одобрены для проведения и выполнены в соответствии с Директивой 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. по охране животных, используемых в научных целях.

Регистрацию параметров АД и ЭКГ осуществляли в утренние часы (с 09:00 до 11:00).

Для введения в наркоз были использованы препараты: Домитор [международное непатентованное наименование (МНН): медетомидин, «Орион Корпорейшн», Финляндия], 1% раствор для инъекций, внутримышечно, 10–15 мкг/кг и Пропофол-ново (МНН: пропофол, ООО «Новофарм-Биосинтез», Украина), эмульсия для внутривенного введения, 10 мг/мл, внутривенно, в начальной дозе 1 мг/кг. Через 10 мин после введения Домитора животным устанавливали внутривенный катетер в бедренную вену и вводили пропофол. Через 3 мин после наступления устойчивой наркотизации начинали регистрировать АД и ЭКГ.

Влияние данного режима наркотизации (медетомидин + пропофол) на показатели АД и ЭКГ животных уже было изучено в нескольких исследованиях [11–14]. При использовании аналогичных доз наркоза у собак отмечалось снижение ЧСС [11–14]. Что касается АД, то ситуация менее однозначная — в одном исследовании оно оставалось неизменным [12], в остальных имело тенденцию к увеличению [11, 13, 14]. При этом не отмечалось изменения параметров ЭКГ в исследованиях [12, 13].

АД [систолическое (САД) и диастолическое (ДАД)] у животных измеряли неинвазивным методом при помощи прибора для измерения артериального давления у лабораторных животных [ветеринарный монитор давления Zoomed BPM-2 (ООО «Зоомед», Санкт-Петербург, Россия)]. Манжету для измерения давления располагали на грудной конечности. Проводили 3 последовательных измерения с интервалом между ними не менее 2 мин, анализировали среднее значение.

После измерения АД проводилось снятие параметров ЭКГ с помощью компьютерного электрокардиографа для ветеринарии «Поли-спектр-8/E» (ООО «Нейрософт», Россия). ЭКГ записывали и анализировали в течение минуты в отведении II, оценивали следующие показатели: ЧСС, а также продолжительность RR, P, PQ, QRS, QT (в мс) и амплитуду зубцов R, Р, Q, S, T (в мВ).

Для подбора наиболее оптимальной формулы расчета скорректированного QT использовали 3 формулы (табл. 1), далее интервалы QTc и RR наносили на график рассеивания с QTc (либо с нескорректированным QT) на оси Y и интервалом RR на оси X. Было построено 4 графика рассеивания (3 — по QTc и 1 — по нескорректированному QT). Наклон регрессионной прямой QTc, близкий к нулю, указывает на согласованность в расчете значений QTc в полученном диапазоне ЧСС [15].

Для всех данных применена описательная статистика: результаты проверяли на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. В случае нормального распределения рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку среднего (SEM), а также минимальное (MIN) и максимальное значение (MAX), которые вместе со значением n (количество наблюдений) представлены в итоговых таблицах. Также для расчета референтных интервалов проводился расчет промежутка 2,5–97,5 процентиля вне зависимости от типа распределения данных. Для оценки данных с признаками нормального распределения при сравнении самцов и самок применяли критерий Стьюдента. Различия определяли при уровне значимости р≤0,05. Статистическую обработку результатов и построение диаграмм рассеивания (Scatter plot) осуществляли в программе Statistica 10.

Результаты и обсуждение

Результаты измерения АД показаны в табл. 2. Поскольку отличий в показателях АД между самцами и самками не выявлено (критерий Стьюдента p>0,05), данные представлены без разделения по полу. На рис. 1 графически показан разброс индивидуальных значений.

ЭКГ наркотизированных собак, как и ожидалось, характеризовалась наличием синусовой аритмии (рис. 2), поэтому в анализ включали минимальную и максимальную длительность интервала RR (за 1 мин регистрации), а также среднее значение длительности интервала RR за время регистрации (табл. 3).

В среднем ЧСС составляла 40 в минуту (см. табл. 3). Синусовый ритм характеризовался периодами учащения и урежения сердечных циклов. Равномерность распределения этих периодов в ходе регистрации ЭКГ у всех животных позволила сделать вывод, что изменение частоты ритма происходило синхронно с фазами дыхания (ЧСС увеличивалась при вдохе и снижалась при выдохе) [16].

Известно, что наличие синусовой аритмии физиологически характерно для ЭКГ собак [17]. Это связано с тем, что у собак присутствует циклическое усиление и ослабление парасимпатической эфферентной активности с дыханием, что вызывает циклическое ускорение и замедление сердечного ритма — дыхательную синусовую аритмию. При анализе 12 последовательных сердечных циклов обычно охватывается период времени, эквивалентный как минимум трем дыхательным циклам, и это позволяет свести к минимуму последствия синусовой аритмии у собак. Когда ЧСС регулярна и записи ЭКГ хорошего качества, измерение параметров одного сердечного цикла показывает значения, сходные с таковыми, полученными путем измерения большего числа циклов и усреднения [8].

Стоит отметить, что у собак размер и форма зубца Т сильно варьируют у разных животных (рис. 3, 4).

Это нужно учитывать при измерении интервала QT. Рекомендуется измерять его от самого раннего начала комплекса QRS до самого позднего конца зубца T (его следует определять путем экстраполяции прямой линии терминальной части зубца T до точки, где он пересекает базовую линию) (рис. 5). В случае двухфазного зубца T его также необходимо измерять до конца. Небольшие зубцы U, хотя и редко встречающиеся у собак, не должны учитываться при измерении. Для простоты измерения можно провести касательную к самой крутой части конца зубца Т (рис. 6) [7, 8].

На практике этот метод может быть более трудоемким, но он позволяет с большей точностью обнаружить изменения в интервале QT. Если зубец T двухфазный, следует выбрать конец более высокого отклонения. Во многих случаях конец зубца T несколько нечеткий либо из‑за наличия зубца T с низкой амплитудой, либо из‑за несколько выступающего зубца U. Это может отражать раннюю постдеполяризацию и должно быть включено в измерение. Точное определение интервала QT, особенно окончания зубца T, иногда представляет сложность как для опытного специалиста, так и для компьютерных алгоритмов. Таким образом, на количественную оценку QT влияет неточность, связанная с идентификацией окончания зубца Т на ЭКГ [8].

В табл. 4 и 5 представлены результаты оценки параметров ЭКГ у наркотизированных собак породы бигль. Поскольку отличий между самцами и самками в регистрируемых параметрах не выявлено (критерий Стьюдента p>0,05), данные представлены без разделения по полу.

На основании полученных данных были рассчитаны показатели QTc. Результаты расчета представлены в табл. 5.

Диаграммы рассеивания интервала QTc и регрессионные прямые, основанные на формулах Базетта, Фридерика и Саги, представлены на рис. 7–10.

После оценки всех данных выявлено, что наименьший наклон регрессионной прямой на данном диапазоне ЧСС отмечается при использовании нескорректированного QT (табл. 6). Все остальные формулы, скорее, имели свойства увеличивать наклон регрессионной прямой, при этом занижая QTc по мере увеличения интервала RR (снижение ЧСС).

Таким образом, по данным оценки результатов эксперимента можно сделать вывод, что у лабораторных собак при применении данного способа наркотизации и регистрации ЭКГ расчет QTc ни по одной из примененных формул нецелесообразен. Возможно, это связано с достаточно низкими (менее 57) показателями ЧСС.

По результатам измерения показателей АД и ЭКГ были получены данные исследования 42 животных, что является достаточным для построения референтных интервалов (РИ) [18].

РИ — статистический показатель, двумя пределами ограничивающий центральный 95% диапазон референтных значений. Этот показатель определяют на выборке условно здоровых людей или животных, для того чтобы установить статистические нормы по какому‑либо показателю, который характеризует данную популяцию [19].

Согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (CLSI), в каждом исследовательском центре целесообразно создавать собственные РИ [19].

Существует два основных метода для расчета пределов РИ: параметрический и непараметрический. Плюсы непараметрического метода: он не требователен к распределению данных, и это делает его предпочтительным при создании РИ биологических показателей, которые зачастую имеют ненормальное распределение [19].

Далее, согласно руководству CLSI для показателей АД и ЭКГ, проводили расчет промежутка 2,5–97,5 процентиля, диапазон между которыми служил РИ для этих показателей в условиях нашей лаборатории (табл. 7) [18].

Ниже представлены данные, полученные в других исследовательских центрах по показателям АД (табл. 8) и ЭКГ (табл. 9).

Данные, полученные в разных научных центрах, демонстрируют достаточно большую вариабельность (см. табл. 8, 9), что еще раз указывает на необходимость разработки в каждой лаборатории подхода к интерпретации показателей с использованием собственных опорных значений, полученных на конкретной породе собак и при определенных экспериментальных условиях [25]. Вариабельность результатов зависит, во‑первых, от состояния животных в момент регистрации параметров (бодрствующие животные или наркотизированные), а во‑вторых, от конкретных препаратов, использованных для наркотизации (в случае регистрации параметров на наркотизированных животных). Эти факторы оказывают влияние на АД, ЧСС, интервал RR и общую продолжительность сердечного цикла.

Заключение

При анализе ЭКГ у собак следует учитывать наличие выраженной синусовой аритмии и крайне нерегулярный размер и форму зубца Т. При анализе 12 последовательных сердечных циклов обычно охватывается период времени, эквивалентный как минимум трем дыхательным циклам, и это позволяет свести к минимуму последствия синусовой аритмии у собак [8].

При оценке ЭКГ должно быть уделено внимание точному определению интервала QT, который следует измерять от самого раннего начала комплекса QRS до самого позднего конца зубца Т. Вследствие многочисленных причин, влияющих на показатели интервала QT, трудно оценить клиническую и биологическую значимость незначительных изменений, даже если они статистически достоверны [8].

Для оценки влияния препаратов на интервал QT могут быть использованы различные формулы расчета интервала QTc. В любом случае наиболее подходящий поправочный коэффициент должен определяться в каждой лаборатории с использованием собственных данных, полученных от собак определенной породы и при контролируемых экспериментальных условиях. Кроме того, когда введение препарата приводит к значительным изменениям ЧСС, алгоритмы коррекции частоты QT неудовлетворительны и могут давать неточные оценки QTc [8].

Результаты проведенного анализа показали, что применительно к условиям данного эксперимента (наркотизация: пропофол 1 мг/кг + Домитор 10–15 мкг/кг) оценка QTc с использованием нескольких наиболее часто применяемых подходов [формулы Базетта (Bazett), Фридерика (Fridericia) и Саги (Sagie)] нецелесообразна. Возможно, это связано с достаточно низкими (менее 57) показателями ЧСС, которые отмечаются у собак при таком способе наркотизации.

Поскольку большое количество факторов оказывает влияние на показатели ЭКГ и АД у собак, важно рассчитать внутрилабораторные референтные интервалы по физиологическим значениям животных с использованием собственных данных, полученных на конкретной породе животных и при определенных экспериментальных условиях с учетом всех факторов, потенциально влияющих на результаты (циркадные ритмы, оборудование, анализируемые отведения, наркотизация и др.) [25]. По результатам проведенного эксперимента установлены референтные интервалы по основным показателям ЭКГ [продолжительность RR, P, PQ, QRS, QT (в мс) и амплитуда зубцов R, Р, Q, S, T (в мВ)], а также АД (САД и ДАД). Это позволит в дальнейшем более эффективно оценивать изменения функциональных значений сердечно-сосудистой системы у собак при определении фармакологической безопасности лекарственных средств.